图示pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗*基因；mel为黑*素合成基因，其表达能...

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图示pIJ702是一种常用质粒，其中tsr为硫链丝菌素（一种抗生素）抗*基因；mel为黑*素合成基因，其表达能使白*的链霉菌菌落变成黑*菌落；而限制酶SacⅠ、 SphⅠ， BglⅠ在pIJ702上分别只有一处识别序列。回答下列问题。

表1

表2

“+”表示生长；“-”表示不生长。

（1）限制*内切核*酶可以识别双链DNA中特定核苷*序列，并使每条链中特定部位的两个核苷*之间_______的断裂，切割形成的末端有_______两种。

（2）以SacⅠ和SphⅠ切取的目的基因置换质粒PIJ702上长度为0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，构建重组质粒pZHZ8。上述两种质粒的限制酶酶切片段长度见表1。由此判断目的基因的片段长度为_____kb，判定目的基因中含有一个BglⅡ切割位点的理由是____________________________。

（3）导入目的基因时，首先用______处理链霉菌使其成为感受态细胞，再将重组质粒pZHZ8溶于________中与感受态细胞混合，在一定的温度下可以促进链霉菌完成______过程。

（4）不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素的固体培养基上生长状况如表2所示。若要筛选导入pzHZ8的链霉菌细胞，所需硫链丝菌素浓度至少应在______μg/mL以上，挑选成功导入pZHZ8的链霉菌的具体方法是________________________。

【回答】

    (1). **二酯键    (2). 黏*末端和平末端    (3). 1．4    (4). pIJ702上的原有BglⅡ位点被目的基因置换得到的环状pZH28，仍能被BglⅡ切割成一条线段    (5). Ca2+    (6). 缓冲液    (7). 转化    (8). 5    (9). 根据导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑*、导入pZHZ8的链霉菌菌落呈白*的特点，通过观察菌落的颜*进行挑选

【解析】

该题主要考察了基因工程的相关*作，基因工程的基本*作步骤为目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入到受体细胞、目的基因的检测与鉴定。限制*核*内切酶主要作用于识别序列的**二酯键，切割完以后可能会产生黏*末端或者是平末端。将目的基因导入受体细胞时，常常使用Ca2+使得受体细胞成为感受态细胞。

【详解】（1）限制*内切核*酶是作用于其所识别序列中剪切位点的**二酯键，不同的限制酶可以获得不同的末端，主要分为黏*末端和平末端；

（2）由题干可知，质粒PIJ702上具有长度为0．4kb的SacⅠ/sphⅠ片段，使用SacⅠ和SphⅠ切取质粒会多置换下0.4kb的片段，而BglⅡ在原质粒和重组质粒上的切割片段相差1.0kb，介于BglⅡ的识别位点位于SacⅠ和SphⅠ之间，所以推测目的基因的片段长度应该为1.0+0.4=1.4kb；在表格中可以反应出重组质粒可以被BglⅡ限制酶切割，切割后称为一条线段，但原有质粒上的相关片段已经被SacⅠ和SphⅠ置换为目的基因，因此推测目的基因中也含有1个BglⅡ切割位点；

（3）将目的基因导入到受体细胞之前，需要将受体细胞用Ca2+处理使得受体细胞成为感受态细胞；然后重组质粒要溶解到缓冲液中与感受态细胞融合；从而促进链霉菌完成转化的过程；

（4）根据图中的表格可知，要想对重组的链霉菌细胞进行筛选，应该满足不含质粒的链霉菌无法生长的要求，因此所需硫链丝菌素浓度至少应在5μg/mL以上；在该质粒上存在一个mel基因，其表达的产物会使得白*的链霉菌菌落变成黑*菌落，所以导入pIJ702的链霉菌菌落呈黑*，而重组质粒pZHZ8在构建的时候破坏了mel基因，所以该重组质粒导入到链霉菌后菌落呈白*，后通过观察菌落的颜*进行挑选。

【点睛】该题的难点在于基因表达载体的建构，由于切割位点及相对应的限制酶较多，所以准确分析目的基因及质粒的长度和结构就对学生有一个综合*的考察。而目的基因的检测与鉴定则需要在理解以上重组质粒的构建过程的基础上分析标记基因的应用情况。

知识点：生物技术的安全*和伦理问题

题型：综合题